HDN的诊断除应注意产妇的妊娠史，分娩史、输血史及健在子女的血型和健康状况外，无论对诊断与治疗实验室诊断都是非常重要的。
1．确诊患婴的依据
（1）红细胞直接抗球蛋白试验阳性：从患儿红细胞上直接查到了被吸附的抗体，证明红细胞已经受累。本试验为直接证据。
（2）从红细胞上释放了具有血型特异性的抗体：①用热释放法检查AB0血型不合婴儿的红细胞是否释放了抗A，抗B，抗A、B抗体或AB0血型系统以外的抗体。②用乙醚释放法检查Rh血型不合的婴儿红细胞是否释放了抗D、抗C或抗E抗体。本试验也为直接证据。
（3）血清中存在与患婴红细胞上抗原相对应的游离抗体。
2．辅助诊断依据
（1）高胆红素血症：出生时脐血胆红素超过85．8mol／L。（50mg／L），24h血清胆红素超过102．6Fmol／L。（60mg／L），且以未结合胆红素为主。
（2）孕母血清内查到与胎儿红细胞不相合的完全抗体。
3．产前试验如怀疑有HDN可能时，最好在产前开始检查，以期及早诊断及采取适当的预防与治疗措施。
（1）血清学检查：首先要对孕妇做AB0血型系统及Rh系统的D抗原检查及不规则抗体筛选，所有筛选出阳性抗体都要区别是IgG或IgM，并应进一步做抗体鉴定分析，以确定是否会引起HDN．因为抗体的存在并不一定都会发生HDN．
（2）羊水分析：有必要时，并且在有条件的情况下可以做子宫穿刺抽取羊水进行分析，检查胎儿血型物质，确定胎儿血型。在450 nm处测定胆红素含量的吸光度值，吸光度值越高表示官内溶血越严重。
